Interpretazione array-CGH

Definizione

Il CMA (Chromosomal Microarray Analysis) — comunemente chiamato array-CGH (Comparative Genomic Hybridization) — confronta il DNA del paziente con un DNA di riferimento su un microarray, rilevando le CNV (Copy Number Variants): delezioni e duplicazioni submicroscopiche.

Le piattaforme SNP-array aggiungono la capacità di rilevare le ROH (Regions of Homozygosity), indicative di consanguineità o disomia uniparentale (UPD).

Risoluzione

Risoluzione tipica: 50–100 kb (rispetto a 5–10 Mb del cariotipo convenzionale = 10–20× superiore). Le piattaforme ad alta densità raggiungono 20–50 kb nelle regioni clinicamente rilevanti.

Cosa rileva

• Delezioni (perdita di materiale genomico)
• Duplicazioni (guadagno di materiale genomico)
• Aneuploidie (trisomie, monosomie)
• Riarrangiamenti sbilanciati
• ROH (solo SNP-array) — suggestive di consanguineità o UPD

Cosa NON rileva

• Traslocazioni bilanciate e inversioni
• Mutazioni puntiformi (varianti a singolo nucleotide)
• Mosaicismo a bassa percentuale (<15–20%)
• Difetti di metilazione (sindromi da imprinting senza CNV)
• Espansioni di triplette nucleotidiche (es. X Fragile, distrofia miotonica)

I limiti di rilevamento sono approfonditi nella Sezione 6.

Riferimento chiave

ACMG 2010 (Miller DT et al., Am J Hum Genet) — il CMA è raccomandato come test di primo livello nella valutazione di disabilità intellettiva (ID), disturbo dello spettro autistico (ASD) e anomalie congenite multiple (MCA).

Confronto tra tecniche diagnostiche

Indicazioni maggiori

• Anomalie congenite multiple — ≥2 anomalie maggiori OPPURE 1 maggiore + 2 minori
• Dismorfismi facciali
• Cardiopatia congenita conotruncale — sospetto 22q11.2 (DiGeorge/VCF)
• IUGR severo con dismorfismi
• DSD (Disorders of Sex Development)
• Ipotonia neonatale severa
• Anomalie cerebrali strutturali — agenesia del corpo calloso (ACC), lissencefalia, oloprosencefalia (HPE)
• Ernia diaframmatica congenita (CDH)

Indicazioni relative

• Palatoschisi
• Anomalie renali bilaterali
• Associazione VACTERL
• Idrope non immune
• Anamnesi familiare per riarrangiamenti sbilanciati
• Nato morto (stillbirth) con fenotipo sospetto

3.1 Struttura tipica del referto

Un referto di array-CGH segue generalmente una struttura standardizzata:

1. Dati del paziente e indicazione clinica — motivo della richiesta (es. ritardo psicomotorio, dismorfismi, cardiopatia congenita)
2. Piattaforma utilizzata — es. Agilent SurePrint G3 8x60K, Illumina CytoSNP-850K, con indicazione della risoluzione media
3. Risultato principale — normale (nessuna CNV clinicamente significativa) oppure elenco delle CNV identificate
4. Descrizione delle CNV in nomenclatura ISCN — coordinate genomiche, tipo (gain/loss), dimensione
5. Interpretazione clinica — classificazione di ogni CNV secondo il sistema a 5 classi ACMG/ClinGen
6. Raccomandazioni — test di conferma (FISH, MLPA, qPCR), test parentali per definire l'origine (de novo vs ereditata)

3.2 Terminologia fondamentale

3.3 Classificazione ACMG/ClinGen a 5 classi

Ogni CNV identificata viene classificata secondo le linee guida ACMG/ClinGen (Riggs et al., 2020):

3.4 Nomenclatura ISCN — Come leggerla

Esempio di risultato in nomenclatura ISCN:

arr[GRCh38] 22q11.21(18,916,842-21,465,659)x1

Scomposizione di ogni componente:

• arr = risultato da microarray
• [GRCh38] = versione del genoma di riferimento (hg38)
• 22q11.21 = banda cromosomica coinvolta
• (18,916,842-21,465,659) = coordinate genomiche (inizio–fine in bp)
• x1 = numero di copie rilevate (x1 = delezione eterozigote, x0 = delezione omozigote, x3 = duplicazione)
• Dimensione = differenza tra le coordinate → in questo caso ~2.5 Mb (sindrome da delezione 22q11.2 / DiGeorge)

3.5 Soglie dimensionali

3.6 Gestione delle VUS (Varianti di Significato Incerto)

Approccio sistematico alla gestione di una VUS:

1. Valutazione della CNV: considerare dimensione, contenuto genico (geni OMIM morbid, score ClinGen di aploinsufficienza ≥2), localizzazione (regione priva di geni → probabilmente benigna)
2. Test parentali: array-CGH o FISH su entrambi i genitori. Se de novo → probabilmente patogena. Se ereditata da genitore sano → probabilmente benigna (attenzione alla penetranza incompleta e all'espressività variabile)
3. Consultazione database:
   • ClinGen — score di aploinsufficienza e triplosensitività
   • DECIPHER — pazienti con CNV simili e fenotipi associati
   • DGV — frequenza nella popolazione generale (se >1% → benigna)
   • gnomAD SV — varianti strutturali in popolazioni di riferimento
   • OMIM — correlazione gene-malattia
4. Rivalutazione fenotipica: confronto sistematico tra i geni contenuti nella CNV e il fenotipo del paziente
5. Follow-up: rivalutare la classificazione dopo 12–24 mesi, poiché nuove evidenze in letteratura possono modificare l'interpretazione

Le 12 sindromi da microdelezione/microduplicazione più rilevanti in neonatologia. Clicca su ogni sindrome per espandere i dettagli clinici.

L'algoritmo seguente guida l'interpretazione dei risultati dell'array-CGH e la scelta dei test di secondo livello, dalla refertazione iniziale fino all'eventuale escalation verso WES/WGS.

Quando la FISH è sufficiente

In presenza di un sospetto clinico forte per una sindrome nota (es. delezione 22q11.2, sindrome di Williams 7q11.23), la FISH rappresenta il test di conferma più rapido, con risultato disponibile in 24–48 ore. È indicata quando il fenotipo è altamente suggestivo e si desidera una conferma urgente senza attendere i tempi dell'array.

Quando richiedere il test di metilazione

Il test di metilazione (MS-MLPA come primo livello) è indicato nel sospetto di sindromi da imprinting: Prader-Willi, Angelman, Beckwith-Wiedemann, Silver-Russell. La sensibilità per Prader-Willi è >99%, indipendentemente dal meccanismo (delezione, UPD, difetto di imprinting). L'array-CGH rileva solo le delezioni, non la UPD né i difetti epigenetici.

Quando richiedere WES/WGS

Se l'array è normale e il fenotipo è complesso senza diagnosi, l'exome sequencing (WES) offre una detection rate addizionale del 25–40% nei neonati con anomalie congenite multiple. Il WGS rapido (<2 settimane) è disponibile in alcuni centri: lo studio NICUSeq (Krantz 2021) ha dimostrato un cambiamento del management clinico nel 21% dei casi.

Quando richiedere il cariotipo

• Sospetto di traslocazione bilanciata (genitori con aborti ricorrenti)
• Sospetto di mosaicismo: FISH interfase su 100–200 nuclei
• Necessità di cariotipo su fibroblasti per mosaicismo tessuto-specifico (es. Pallister-Killian, tetrasomia 12p)

Sospetto X fragile

In caso di ipotonia + macrocefalia relativa + familiarità per disabilità intellettiva, richiedere il test molecolare FMR1 (espansione CGG). L'array-CGH non rileva le espansioni trinucleotidiche.

Sospetto SMA

In caso di ipotonia severa + areflessia, richiedere MLPA o PCR per delezione SMN1. L'array-CGH non rileva le delezioni in questa regione a causa delle segmental duplications SMN1/SMN2.

L'array-CGH ha limiti importanti che il neonatologo deve conoscere per evitare falsi negativi e interpretazioni errate.

Insidie tecniche

• Regioni pericentromeriche e subtelomeriche: copertura ridotta su alcune piattaforme — possibili CNV non rilevate in queste regioni critiche.
• Segmental duplications: possibili falsi positivi, in particolare nelle regioni SMN e NF1 dove sequenze ripetitive interferiscono con l'ibridazione.
• Tempo di refertazione: 3–6 settimane. Per aneuploidie urgenti (trisomia 13, 18, 21) utilizzare FISH o QF-PCR (risultato in 24–48h).
• Polimorfismi benigni comuni che possono confondere l'interpretazione: delezione 15q11.2 BP1-BP2 (1,5% della popolazione), CNV 1q21.1 (0,2%) — penetranza incompleta, spesso ereditati da genitore sano.

1. Miller DT et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am J Hum Genet 2010;86:749–764.
2. South ST et al. ACMG Standards and Guidelines for constitutional cytogenomic microarray analysis. Genet Med 2013;15:901–909.
3. Riggs ER et al. Technical standards for the interpretation and reporting of constitutional copy-number variants: a joint consensus recommendation of ACMG and ClinGen. Genet Med 2020;22:245–257.
4. Manning M, Hudgins L. Array-based technology and recommendations for utilization in medical genetics practice. Genet Med 2010;12:742–745.
5. de Leeuw N et al. Diagnostic interpretation of array data using public databases and internet sources. Hum Mutat 2012;33:930–940.
6. Krantz ID et al. Effect of whole-genome sequencing on the clinical management of acutely ill infants with suspected genetic disease (NICUSeq). JAMA Pediatrics 2021.
7. Willig LK et al. Whole-genome sequencing for identification of Mendelian disorders in critically ill infants. Genet Med 2015;17:774–781.
8. Reddy UM et al. Karyotype versus microarray testing for genetic abnormalities after stillbirth. NEJM 2012;367:2185–2193.
9. ISCN 2020 — International System for Human Cytogenomic Nomenclature. Karger, 2020.